痙攣型腦性癱瘓(SCP)大鼠模型【簡(jiǎn)介】痙攣性腦癱指發(fā)育異常引起的運(yùn)動(dòng)和感覺功能落后,，造成肢體肌張力增高,、腱反射亢進(jìn)等一系列綜合征,。本實(shí)驗(yàn)利用腦立體定位解剖圖譜,對(duì)大鼠的錐體束部位進(jìn)行精確的立體定位,通過(guò)微量注射器對(duì)大腦錐體束所在部位注射無(wú)水乙醇造成錐體束壞死,的模擬了痙攣型腦癱的解剖學(xué)及病理改變,術(shù)后大鼠產(chǎn)生明顯的屈曲痙攣癥狀,且屈肌肌張力增高,癥狀和體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),穩(wěn)定性良好。從而建立一種可復(fù)制性良好且痙攣持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的穩(wěn)定的大鼠痙攣型腦癱動(dòng)物模型,為進(jìn)一步深入的探究痙攣型腦癱的基礎(chǔ)研究和臨床診治打下基礎(chǔ)【目的】痙攣型腦性癱瘓(SCP)大鼠模型建立【動(dòng)物】SPF級(jí)SD大鼠,，雄性,，周齡6~8W，體重：200~250g【方法】1,、大鼠麻醉,，顱頂脫毛備皮；2,、大鼠腦定位儀固定大鼠,，顱頂正中切口，長(zhǎng)度約2cm開口暴露前囟及矢狀縫,；3,、縫線將皮膚左右分開固定，前囟后10mm,、矢狀縫左側(cè),；4,、微量注射器移至開孔處修正骨孔，注射器垂直向顱內(nèi)插入,，緩慢注射無(wú)水乙醇15ul,，注射完移除注射器，棉球壓迫止血,；5,、縫合創(chuàng)口后維持25°體溫，等待蘇醒,，觀察大鼠狀態(tài),。【觀察】術(shù)后3天模型大鼠攝食減少,、右側(cè)肢體跛行,、右前肢不負(fù)重、右前肢及右前爪屈曲痙攣明顯,。動(dòng)物疾病模型是一種用于研究人類疾病的重要工具,。云南血液科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)

RNA甲基化修飾（m6A）研究RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上為普遍的修飾,。目前發(fā)現(xiàn)microRNA,，circRNA,rRNA,tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上,，其功能由“編碼器(Writer)”,、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶,，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14,WTAP和KIAA1429,；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化,；m6A由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和HNRNPC）,。m6A酶系統(tǒng)METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細(xì)胞,、Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中m6Apeaks的減少,。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器－核小斑（Nuclearspeckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān),。WTAP與METTL3–METTL14二聚體相互作用,，并共定位于核小斑，影響甲基化效率,，參與mRNA剪,。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基,。天津外包科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)動(dòng)物造模 | 膿毒癥造模方法之CLP造模法。

這種細(xì)胞保持著其原始的生物學(xué)特性,，具有高度的活性和分裂能力,。原代細(xì)胞在許多生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要地位，包括藥物篩選,、疾病模型的建立以及疫苗研發(fā)等,。原代細(xì)胞的獲得通常是通過(guò)組織剪切、消化或酶解等方式從機(jī)體或組織中分離出來(lái),。這些細(xì)胞脫離了它們?cè)谏矬w中的環(huán)境,，但是仍然保持著其基本的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞膜,、細(xì)胞核,、細(xì)胞器以及其他重要的生物分子。原代細(xì)胞在未經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的情況下,，保持著其原始的生物學(xué)特性,，因此，它們常常被用于藥物篩選,、毒理學(xué)研究等。同時(shí),，由于原代細(xì)胞具有高度活性和分裂能力,，它們也被用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，如皮膚移植,、骨頭修復(fù)和神經(jīng)再生等,。此外，原代細(xì)胞模型在疾病研究中也扮演著重要角色,。由于原代細(xì)胞具有更高的生物真實(shí)性,，使用它們建立的疾病模型能夠更準(zhǔn)確地模擬疾病的發(fā)展過(guò)程和藥物的作用機(jī)制，從而為新藥研發(fā)和疾病治,、療提供更有效的工具,。總之,，原代細(xì)胞是一種具有高度活性和分裂能力的細(xì)胞,，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的作用。由于其原始的生物學(xué)特性,。

1.首要原則：細(xì)胞不重要情況下立即丟棄,，培養(yǎng)箱滅菌，所用培養(yǎng)基也都要丟棄,，器械等重新滅菌或拆用新的,。2.細(xì)菌污染一般都救不回來(lái)了,，發(fā)現(xiàn)的時(shí)候培養(yǎng)基一般都很渾濁且細(xì)胞都死了3.污染且細(xì)胞很重要時(shí)：遇到念球菌污染，且細(xì)胞為基因改造細(xì)胞,，非常重要,。如231貼壁乳腺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周圍出現(xiàn)很小的串珠透亮圓點(diǎn),，非常像念球菌污染,，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)尚可，且污染少,。處理如下：用預(yù)熱或室溫PBS清洗3次,，可適當(dāng)振搖，將污染沖洗下來(lái),。隨后加入10-20%雙抗到培養(yǎng)瓶,，置于37度培養(yǎng)箱1h，之后再用PBS清洗三遍,，直至視野下無(wú)可見污染,。此時(shí)細(xì)胞也被沖下大部分，因此此方法只適用在細(xì)胞貼壁強(qiáng),，狀態(tài)好,，密度高時(shí)使用。之后每天再更換培養(yǎng)基,，每次用PBS沖洗2遍,。過(guò)幾天細(xì)胞狀態(tài)尚可時(shí)，消化離心時(shí)用500r,，3min,，去掉上清，重復(fù)3次,。這個(gè)方法是根據(jù)文獻(xiàn)可利用念球菌和細(xì)胞體積重量差異實(shí)現(xiàn)分離,。基本上這一步做完以后,，污染就基本了,，接下來(lái)就注意多觀察，勤換液就行,。常用于研究細(xì)胞的成瘤能力,、細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的耐藥和靶分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展的影響等等,。

是整體甲基化進(jìn)程所必須的[2],。FTO是ALKB家族的成員，作為個(gè)被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結(jié)合能力,，進(jìn)而調(diào)控pre-mRNA的剪切加工過(guò)程[3],。目前已發(fā)現(xiàn)FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長(zhǎng)遲緩相關(guān),，揭示m6A可能對(duì)這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能[4-6],。ALKBH5是ALKB家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個(gè)成員，以RNaseA敏感的方式與核小斑共定位,，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外,，ALKBH5和它的去甲基化活性影響新生mRNA合的成和剪切效率[7]，且ALKBH5敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常,，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果[7],。m6AmRNA修飾執(zhí)行其功能主要通過(guò)兩個(gè)途徑：精細(xì)調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，以阻止或誘使蛋白-RNA相互作用,；或被直接由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別,，誘發(fā)續(xù)反應(yīng)。目前一類含有YTH功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為m6A修飾的結(jié)合蛋白,。其中YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,，YTHDC1和YTHDC2己被證實(shí)是ｍ６Ａ的結(jié)合蛋白.YTHDF1主要影響ｍ６Ａ修飾基因的翻譯，YTHDF2主要影響ｍ６Ａ修飾基因的降解,，而YTHDC1結(jié)合ｍ６Ａ修飾的基因影響其剪接,。HNRNPC是一種豐富的核RNA結(jié)合蛋白，參與pre-mRNA的加工[8],。細(xì)胞器是細(xì)胞內(nèi)的各種功能結(jié)構(gòu),，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、高爾基體等，它們各自承擔(dān)著不同的生理功能,。貴州科研技術(shù)服務(wù)外包

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)這些取樣細(xì)節(jié),，你有注意嗎？云南血液科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)

把膜先用TBST泡洗兩遍再用5%脫脂奶粉或者BSA室溫封閉1-2小時(shí),。注意一定要讓蛋白面充分接觸封閉液,。2、孵一抗脫脂奶粉封閉的話,，要用TBST泡洗三遍再轉(zhuǎn)移至一抗溶液中,，BSA封閉的可以直接轉(zhuǎn)移至一抗中。如果膜的寬(膜是一個(gè)長(zhǎng)方形,，這里的寬與長(zhǎng)相對(duì)應(yīng))不大于8毫米,，我習(xí)慣置于15毫升離心管中孵育，兩條膜"背對(duì)背"式放置于一個(gè)管子里(3毫升液體即可)。如果大于8毫米,，就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可),。4度過(guò)夜，一般是12-18個(gè)小時(shí),，注意放置水平,，用搖床。內(nèi)參等蛋白豐度很高的如果孵久了可能出現(xiàn)條帶連在一起的情況,，這時(shí)可以縮短孵育時(shí)間或者降低一抗的濃度,。六、孵二抗顯影1,、孵二抗室溫一個(gè)小時(shí)足矣,。這步要注意的是建議用5%BSA或者脫脂奶粉稀釋二抗，這樣背景會(huì)干凈許多,。也要注意膜的蛋白面要充分接觸二抗溶液,，我們一般一條膜一個(gè)槽地孵。2,、顯影這一步有個(gè)細(xì)節(jié)可能有些同學(xué)沒(méi)注意到,，就是ECL發(fā)光液要與HRP反應(yīng)一分鐘后顯影效果才會(huì)更好，還有要注意的是顯影液要均勻覆蓋,，一般第二次顯影(加新的顯影液)比一次好看,。云南血液科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)